1-1 – COMMENT AMÉLIORER UNE SÉPARATION EN CHROMATOGRAPHIE ? 2- A temps de rétention constant, on peut diminuer la largeur des pics, le chromatogramme (c) illustre ce phénomène. En pratique, on peut jouer à la fois sur ces 2 paramètres pour améliorer une séparation.
Principe physico-chimique
La CPG repose sur l'équilibre de partage des analytes entre une phase stationnaire et une phase mobile gazeuse. La séparation des analytes repose sur la différence d'affinité de ces composés pour la phase mobile et pour la phase stationnaire.
Pour améliorer la séparation, il est possible de jouer sur différents paramètres comme la taille des particules de remplissage de la colonne. En diminuant leur diamètre ou en utilisant des particules plus régulières, on augmente généralement l'efficacité de la colonne.
Présentation de la technique
La chromatographie est une technique séparative analytique et/ou préparative. Elle consiste à faire migrer les constituants à séparer sur une phase stationnaire immobile, à l'aide d'une phase mobile, liquide ou gazeuse, de nature différente.
Guide de choix de la phase mobile
En faisant varier la composition du solvant, on fait varier le coefficient de distribution K et donc le pouvoir d'élution. Les solvants doivent être miscibles et ne pas gêner la détection (absorption UV par exemple).
Pour le choix de l'éluant, on peut commencer par un éluant peu polaire du type cyclohexane et progresser en polarité en fonction des résultats. Si aucun composé migre on peut réutiliser la plaque pour une autre élution à condition de la sécher complètement auparavant.
Avec une phase stationnaire donnée on peut améliorer la résolution de la colonne en augmentant le nombre de plateaux théoriques donc en augmentant la longueur de la colonne. Mais ceci augmente la durée de l'analyse, un compromis est donc nécessaire.
La distillation. La distillation permet de séparer les constituants d'un mélange homogène formé de liquides dont les températures de vaporisation sont éloignées de plusieurs degrès Celcius.
Le facteur principal qui intervient est le coefficient de partage entre chaque phase. On peut séparer des solutés dont les coefficients de partage entre les deux phases sont différents. Les plus solubles dans la phase mobile se déplacent plus facilement que ceux qui le sont moins.
Rincer pour 4 volumes de colonne avec 50/50 Ethanol/eau puis par 100% d'eau (ne pas utiliser d'alcool à chaine longue). Retourner la colonne, rincer avec 0.2M de NaOH à 90°C et à 0.5 ml/min pendant 2 heures, puis retourner la colonne, réguler en température et rcoquilibrer sous solvant initial.
Le débit d'écoulement de la phase mobile est élevé ce qui entraîne une augmentation de la pression dans le système. Ce débit élevé diminue le temps nécessaire pour séparer les composants le long de la phase stationnaire. La fine granulométrie de la phase stationnaire permet une meilleure séparation des composants.
Le temps de rétention est le temps nécessaire à un composé pour éluer de la colonne et être détecté. Conventionnellement, le temps de rétention est déterminé au sommet du pic chromatographique qui correspond généralement à la moitié de l'élution du composé.
Les avantages sont de pouvoir injecter l'échantillon sous forme liquide sans provoquer de vaporisation sélective dans l'aiguille (plus de précision sur le volume d'injection) et à une température la plus basse possible (celle de la colonne) pour éviter la dégradation des composés thermolabiles.
Mise en place du matériel. On place environ 10 mL d'éluant dans la cuve à chromatographie, afin d'avoir un demi centimètre d'éluant au fond de celle-ci. On y place le papier absorbant et on referme la cuve afin de laisser le temps à l'équilibre liquide/vapeur d'être atteint.
3 - Quels sont les principaux gaz vecteurs utilisables en CPG ? Dihydrogène (H2), hélium (He) et diazote (N2). - Quelles sont les précautions à prendre vis-à-vis de ces gaz pour ne pas endommager la colonne ? Ces gaz doivent être de pureté suffisante et notamment être séchés et désoxygénés (au moyen de cartouches).
La filtration permet de séparer un mélange hétérogène composé d'un liquide et d'un solide.
L'évaporation. L'évaporation est une méthode utilisée pour séparer les constituants d'un mélange homogène. L'eau salée est un mélange homogène formé de chlorure de sodium à l'état solide (le sel) et d'eau liquide, il faut effectuer une évaporation de l'eau pour récupérer le sel dissous.
2) Séparer deux liquides miscibles On peut distiller un mélange eau / alocol, par ex du cidre. Pour séparer deux liquides miscibles, il suffit d'utiliser la distillation vue auparavant. Celui des deux liquides qui bout le premier par vers le réfrigérant tandis que l'autre reste dans le ballon.
La décantation. La décantation consiste à laisser reposer un mélange hétérogène suffisamment longtemps pour que les particules solides en suspension tombent au fond du récipient. On peut ensuite verser délicatement dans un autre récipient le mélange qui surnage : on obtient un mélange quasiment homogène.
Re : séparation enantiomere
En pratique, il faut faire réagir avec le mélange une molécule organique chirale. Par exemple, tu souhaites séparer deux isomères d'un produit A : l'isomère A(S) et le A(B). Tu choisis de faire réagir avec le mélange un produit B qui est chiral, par exemple B(R).
fractionnement : séparation d'un mélange complexe en plusieurs mélanges différents.
La phase mobile ou éluant est un liquide qui entraîne les solutés à travers la colonne. K' est aussi le rapport du temps passé par un soluté dans la phase stationnaire sur le temps passé par ce même soluté dans la phase mobile.
Une molécule totalement incluse sera éluée avec un volume d'élution V* = Vm + Vi, où Vi est le volume d'eau interne aux granules de gel(voir plus bas). Les solutés sont donc élués dans l'ordre inverse des masses moléculaires (voir figure ci-dessous).
La chromatographie sur couche mince est la plus simple des méthodes chromatographiques. Elle consiste à placer sur une feuille (papier, silice ou autre, voir plus loin) une tache et de la laisser éluer en la trempant dans un solvant ou un mélange de solvant (appelé éluant), l'éluant diffuse le long du support.