Le principe de la spectrophotométrie est simple : l'appareil réalise une mesure de l'intensité de la lumière qu'il reçoit, une fois celle-ci passée à travers un récipient transparent (cuvette dont la matière doit être adaptée à la longueur d'onde), contenant la solution à étudier.
Le principe de la spectrométrie d'absorption dans l'ultraviolet et le visible repose sur l'absorption du rayonnement par les molécules dans le domaine allant de 190 à 800 nm, ce qui correspond à l'ultraviolet (190-400 nm) et au visible (400-800 nm).
La spectrophotométrie pour déterminer une concentration
Une mesure de l'absorbance peut donc permettre de remonter à la concentration d'une solution. Elle peut du même coup permettre de suivre la cinétique d'une réaction chimique.
Un spectrophotomètre comprend essentiellement trois parties : la zone d'excitation, la zone échantillon et la zone de détection. Ces différentes parties peuvent être indépendantes les unes des autres, ce qui permet d'avoir un appareil évolutif et perfectible.
Dans quoi est mesurée l'absorbance ? L'absorbance est mesurée à l'aide d'un spectrophotomètre ou d'un lecteur de microplaques, qui est un instrument qui émet une lumière d'une longueur d'onde spécifiée à travers un échantillon et qui mesure la quantité de lumière absorbée par l'échantillon.
L'absorbance A est une grandeur qui mesure l'absorption de la lumière par une solution colorée. L'absorbance dépend de la concentration de la solution et de la longueur d'onde de la lumière qui traverse la solution. La loi de Beer-Lambert donne la relation entre l'absorbance A et la concentration C : A = ε l C.
le blanc sert à enlever les artefacts de mesure lié au matériel (tampon ,eau, cuve...)
Son principe repose sur la dispersion de la lumière par un réseau. Lorsque les photons (« grains » de lumière) traversent une pierre, certaines couleurs sont absorbées. Elles sont soustraites du spectre de la lumière blanche et le résultat final se traduit par la couleur ap- parente de la pierre.
Isaac Newton est le fondateur de la spectroscopie. Il a été le premier à comprendre que l'étalement des couleurs par le prisme est lié à la nature intrinsèque de la lumière et n'est pas inhérente au prisme (1666).
L'absorbance mesure la capacité d'un milieu à absorber la lumière qui le traverse. On utilise aussi les termes densité optique, opacité ou extinction selon les domaines avec des expressions mathématiques qui diffèrent légèrement.
Nous devons garder à l'esprit que le fait d'étalonner le spectrophotomètre à tout moment nous aidera à obtenir des informations beaucoup plus précises de la mesure de la couleur. En outre, dans certains cas, l'appareil lui-même peut ne pas permettre d'effectuer une mesure s'il n'est pas préalablement étalonné.
Introduire dans le spectrophotomètre la cuve qui contient le solvant (eau distillée). Appuyer sur la touche « ZERO » afin de réaliser le réglage du blanc. Remplacer la cuve qui contient l'eau distillée par celle qui contient la solution colorée étudiée.
On règle le spectrophotomètre à la longueur d'onde correspondant au maximum d'absorbance de la solution étudiée, pour une plus grande précision et une plus grande sensibilité des mesures. Le spectre d'une solution de permanganate de potassium, compris entre 400 et 700 nm, donne la courbe ci-contre.
Le principe de la spectroscopie infrarouge (IR) repose sur l'absorption de la lumière par la plupart des molécules dans la région de l'infrarouge du spectre électromagnétique et en convertissant cette absorption en vibration moléculaire.
Principe d'une spectroscopie
L'échantillon à analyser est traversé par un rayonnement lumineux de longueur d'onde allant de 100-800 nm. Les photons issus du rayonnement transfèrent aux composés analysés une énergie qui excite les molécules, atomes ou ions traversés. Ainsi une partie du rayonnement incident est absorbé.
Lorsqu'au cours d'une réaction dont on veut étudier la cinétique, l'une des espèces chimiques en solution est colorée, on peut par spectrométrie d'absorption suivre la concentration de cette espèce. Si cette espèce colorée est un réactif, l'absorbance de la solution diminue au cours du temps.
On remarque que la valeur de l'absorbance A varie en fonction de la concentration en quantité de matière C de la solution. La courbe est une droite qui passe par l'origine : l'absorbance A de la solution est donc proportionnelle à la concentration en quantité de matière C de la solution.
La densité optique ou absorbance désigne le logarithme décimal de l'opacité, c'est-à-dire l'inverse de la transparence. Ce terme est utilisé en photographie pour mesurer la transparence du négatif photographique.
La spectrophotométrie permet de mesurer l'absorbance (appelée aussi densité optique) d'une substance en solution. Pour mesurer cette absorbance, on utilise un spectrophotomètre.
Le principe du spectrographe à prisme repose sur le fait que les longueurs d'onde qui composent la lumière présentent des indices de réfractionindices de réfraction différents. Lorsque la lumière traverse un prisme, sa trajectoire est déviée.
L'interaction du rayonnement électromagnétique avec la matière peut prendre différentes formes ; nous distinguerons ainsi successivement les processus qui sont à la base de tous les phénomènes spectroscopiques : l'absorption, l'émission et la diffusion.
Un spectre continu est un spectre lumineux qui s'étend du violet au rouge sans interruption.
Une solution étalon est une solution qui contient une concentration spécifiée d'un paramètre, tel que le chlore ou le fer.
Le Blanc Réactif : En biochimie, on parle du blanc réactif qui est une solution utilisé pour calibrer la machine de test (spectrophotomètre). Il sert dans le milieu réactionnel destiné à la détermination de l'absorbance de solvant et le réglage de l'appareil à ZERO pour que notre lecture soit correcte.
On appelle facteur de dilution de coefficient k=Ci/Cf=Vf/Vi. Si on reprend l'exemple précédent, le facteur de dilution k=0,10/0,040=2,5 et k=500/200=2,5.